Peter Parker a retrouvé un équilibre de vie et il veut se marier avec Mary Jane. Pendant une nuit au parc, alors que Peter et Mary Jane sont ensemble, une petite météorite tombe tout près du lieu où ils se trouvent, et une particule s'en échappe, libérant, en éclatant, une matière visqueuse, la Venom, qui s'attache à la mobylette de Peter. Pendant ce temps, Flint Marko s'échappe de la prison où il était détenu pour cambriolage afin d'aller revoir sa fillette qui lui manque terriblement, mais dont il n'a pas le droit de s'approcher à cause de l'injonction d'éloignement obtenue contre lui par son ex-femme ; pendant sa fuite, il tombe dans un accélérateur de particules, qui fond son corps avec le sable et il devient l’Homme-Sable. Le meilleur ami de Peter, Harry Osborn, veut venger la mort de son père, et, croyant que Spider-Man est la cause de cette mort, l'attaque.
Opening Montage — Christopher Young
La séquence d’ouverture met en évidence des scènes des films précédents.
They Say It's Wonderful — Frank Sinatra
Song Mary Jane chante au début de sa pièce
They Say It's Wonderful (feat. Kirsten Dunst) — Spider-Man 3 Cast
Peter assiste à une comédie musicale de Broadway dans laquelle MJ joue.
Backstage — Christopher Young
Romantic Night — Christopher Young
Pleased to Meet You — Wolfmother
Gwen et ses collègues participent à une séance photo.
The Twist — Chubby Checker
Danse harry et Mary Jane
Raindrops Keep Fallin' On My Head — B.J. Thomas
Spider Man Drum Cadence — Port Chester High School Marching Band
Mechanized Infantry — Port Chester High School Marching Band
Theme From Spider Man — Port Chester High School Marching Band
People Get Up And Drive Your Funky Soul - Remix — James Brown & Fred Wesley & The J.B.'s
Pierre marchant dans la rue
Signal Fire — Snow Patrol
Chanson du premier générique de fin.
Falling Star — Jet
Troisième générique de fin de chanson.
Move Away (New Mix) — The Killers
Stay Free — Black Mountain
Summer Day — Coconut Records
Portrait of a Summer Thief — Sounds Under Radio
A Letter from St Jude — The WYO's
I'm Through With Love — Marilyn Monroe